והיום אני רוצה לשתף אתכם בתמונה שצילמתי במסגרת עבודתי, של ציליה ממערכת הנשימה.
מדובר בביופסיית הברשה מרירית האף, בה מוציאים תאי אפיתל ושולחים לבדיקה במיקרוסקופ אלקטרונים על מנת לבדוק אפשרות למחלת primary ciliary diskynesis. במחלה זו, שבסיסה גנטי, חסר חלבון מבני בשם dynein הנמצא בחלק החיצוני והפנימי של כל זוג טובולים שנמצאים לאורך הציליה (סה"כ 9 זוגות לכל ריס) והוא האחראי לתנועתיות התקינה של הריסים. זהו אותו החלבון שמזיז את הריסים בעובר, ולכן בפעמים רבות אנשים בעלי מחלה זו, הם בעלי איברים הפוכים (לב בצד ימין, כבד בשמאל וכו').

היום נפל בחלקי לצלם ביופסיה כזו, והתמונות כ"כ טובות, שהחלטתי לחלוק



בתמונה נראים היטב שני ריסים, ובתוכם תשעת הזוגות ההיקפיים וכן הזוג המרכזי של הטובולי. ניתן לראות בבירור את זרוע הדיאנין החיצונית, ובמאמץ קל ניתן לראות גם את הפנימית במספר מקרים. כמו כן ניתן להבחין ב radial spokes, שאלה החלבונים המשאירים את הטובולי מסודרים במרחקים שווים מהזוג המרכזי.

מיכל - 20.1.13
מאיה - 9.11.14
נטע - 2.4.20

להעלות שוב בבקשה.

זנגה זנגה, דאר דאר
(מ.קדאפי)

מוזר, לא אוהב קבצי tiff...

מיכל - 20.1.13
מאיה - 9.11.14
נטע - 2.4.20

מקסים!
טרם ראיתי תמונת מיקרוסקופ אלק' המציגה גם את הradial spokes..
ממש לפוסטר
עריכה: לינק לאשכול המדובר: כיצד העובר מבחין בין שמאל וימין

תודה

כשראיתי את החיתוך והצביעה שיצאו כ"כ מדוייקים (בעיקר החיתוך - הזוית כאן כל כך חשובה) קראתי למישהי שעובדת שם כדי להשוויץ... אמרתי שזו ממש תמונה ל text book

מיכל - 20.1.13
מאיה - 9.11.14
נטע - 2.4.20

שאפו על החיתוך!
עוד לא יצא לי להתנסות בחיתוכים מעין אלו בעצמי, אבל מצפייה אני מבין את הקושי וההישג

אולי ארחיב כאן על תהליך ההכנה לצפיה במיקרוסקופ:

בתור התחלה, מגיעה אלי ביופסיה בגלוטראלדהיד + בופר סודיום קקודילאט. את הדוגמה שוטפים בתמיסת סוכרוז, להוצאת המקבע, ולאחר מכן היא עוברת איקובציה של שעה באוסמיום טטרה אוקסיד - מחמצן חזק שתורם בעצמו לקיבוע בעיקר של שומנים ומעט חלבונים. העבודה עם אוסמיום מאד מסוכנת, ונעשית אך ורק במנדף כימי. כל התהליך נעשה על קרח. את שארית האוסמיום שואבים מהמבחנות (זכוכית. פלסטיק יפורק ע"י האוסמיום) ומנטרלים עם תמיסה של 5% ברזל-סולפט. לאחר שתי שטיפות בבופר, צובעים למשך 1-2 שעות באורניל אצטאט בטמפ' החדר בחושך.

לאחר הצביעה הדוגמה עוברת דהידרציה והחדרה של הפולימר שייצור את הבלוק, מעורב עם פרופילן אוקסיד. שלב ההחדרה מתבצע במהלך הלילה במקרר. בשלב הבא הדוגמה מועברת פתוחה לנידוף באינקובטור 37 מעלות, ומוכנסת לקפסולות ג'לטין ליצירת בלוקים עם פולימר חדש.

לאחר הקשיה במהלך לילה ב-60 מעלות, הג'לטין מוסר ע"י שטיפות חוזרות במים רותחים, והדוגמה מוכנה לחיתוך.
חיתוך הדוגמה נעשה קודם כל ע"י יצירת מעין פירמידה סביב הדוגמה עצמה עם סכין גילוח, והסרת קצה הבלוק לחשיפת הביופסיה. בשלב זה חותכים בסכין זכוכית:


החתכים הם בעובי 2500-3000 ננומטר, אותם שמים על טיפת מים מזוקקים על זכוכית נושאת, ועל פלטה חמה מקבעים לזכוכית. צובעים בטולואידין כחול:

לאחר שמחליטים איזה חלק בחתך רוצים לראות במיקרוסקופ, עושים לו טרימינג - חותכים את כל המסביב שוב בצורת פירמידה.

מחליפים סכין, ובעזרת סכין יהלום אליה צמודה אמבטיית מים מזוקקים:


חותכים חתכים בעובי 80-300 ננומטר. החתכים צפים במים ויוצרים מעין סרט, ואותם מעמיסים על גריד נחושת:


את הגרידים צובעים פעם נוספת באורניל אצטאט, ואח"כ בתמיסת עופרת, והנה - אנחנו מוכנים להסתכלות!

מיכל - 20.1.13
מאיה - 9.11.14
נטע - 2.4.20

שאלת תם: איך יודעים שכל התהליך הזה לא משנה את הדגימה באופן קיצוני?

משלי י"א י"ד

בכמה דרכים:
1. הדגימה קודם כל עוברת קיבוע - כלומר, מה שהיה נשאר באותו מצב. נכון שגם דגימה מקובעת לא נראית בדיוק בדיוק כמו דגימה טריה, אבל ההבדלים הם זניחים.
2. השוואה למיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ פלורוסנטי. אמנם ההגדלות הן שונות לחלוטין, אבל ניתן לדעת שאברונים מסויימים נמצאים באותו מצב פתולוגי, או שמבנה הרקמה נשאר זהה.

ואחרי שאמרתי את כל זה - כן, הרקמה כן משתנה בתוך התהליך. למשל - שומן "הולך לאיבוד" במהלך הדהידרציה, ומשאיר אחריו חללים לא צבועים בדגימה. כנ"ל מאגרי גליקוגן. לגבי גליקוגן - אם ידוע שזה מה שמחפשים, ניתן לעשות את התהליך מעט שונה ולמנוע זאת.

יש רקמות רגישות יותר ופחות לתופעות שמקורן בחומר הקיבוע. ביופסיית כליה, למשל, כמעט לא תושפע (אלא אם הקיבוע היה גרוע) ואילו ביופסיית כבד תושפע מאד, והדבר יתבטא בעיקר בתפיחות של המיטוכונדריה והליזוזומים. כאשר יודעים למה לצפות כאשר מסתכלים על דגימה, יודעים גם להתעלם מארטיפקטים שתלויים בתהליך ואינם פתולוגיים.

מיכל - 20.1.13
מאיה - 9.11.14
נטע - 2.4.20

קצת הרחבה ברשותך [עבור אלו מאיתנו שלא לקחו קורס בביולוגיה של התא]

בתמונה נראה סיב מיקרוטובול במבנה המכונה אקסונם (Axoneme), שקשור לשלד התא.
שלד התא הוא מעין רשת גדולה העשויה סיבים הקובעת את צורתו של התא, עליה מעוגנים האברונים של התא. השלד עצמו משתתף בתהליכים שהתא מבצע.
שלד התא הוא מאוד דינאמי, עובר כל הזמן תהליך פירוק ובנייה לפי הצרכים של התא.
סיב המיקרוטובול משמש בין השאר לתנועה ולחלוקת התא.

לרוב, נמצא את מבנה האקסונם בריסים, ובשוטון (מעין זנב), כאשר הם יצרו מבנה מסודר:
בהיקף המעגל - 9 זוגות של מיקרוטובולין
במרכז המעגל - זוג של מיקרוטובולין.
בנוסף, יש חלבונים שונים המקשרים בין צמדי המיקרוטובולין בהיקף ובמרכז לצורך חיזוק המבנה וכן חלבוני תנועה הקשורים בין זוגות סיבי המיקרוטובולין (ראו תמונה).

חלבוני הדינאין הם החלבונים האחראיים לתנועת הריס/שוטון, הרחבה על הכימיה של התנועה מובאת בספויילר:

זהירות - ספויילר!

מולקולת ATP נקשרת לדינאין, עוברת הידרוליזה (יציאה של פוספט), ובאנרגיה שנפלטת משתמש החלבון לתנועה.
לכל חלבון דינאין יכולות להתחבר 2 מולקולות ATP. בכל צעד של הדינאין על המיקרוטובול נצרכת האנרגיה המתקבלת מהידרוליזה.

הדינאינים נעים רק בכיוון אחד על המיקרוטובול, שיש לו כיווניות.
עצם הקישור וההתנתקות של הדינאינים מהסיבים מאפשרת את התנועה של השוטון או הריס, כיון שיש אלפי דינאינים בכל אקסונם - קישור והתנתקות שלהם יניבו תנועה!
אבל מה בעצם גורם לסיב להתכופף? הרי, אם כל הדינאינים ינועו לאותו כיוון בו זמנית, נקבל מעין תנועת החלקה קדימה ואחורה...
אז ראשית, יש לזכור כי לא כל הדינאינים נעים בבת אחת, חלקם משחררים את האחיזה ומאפשרים תנועה,
בנוסף, כשהדינאינים מנסים להתנתק מהסיבים יש מעין חלבונים "מגשרים" שקושרים אותם כך שנקבל את התנועה קשתית.

מקווה שההסבר היה מובן, וכתוספת אני מצרף סרט ותמונה שבד"כ קל יותר להבין בעזרתם:

ותמונה מויקי

זהירות - ספויילר!